实验原理：

酪酰胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification, TSA）主要是利用酪胺的过氧化物酶反应。酪胺非活性荧光素底物在HRP和过氧化氢的作用下，会被激活产生活化荧光底物，同时形成共价键结合位点，共价结合在蛋白抗原表面或附近的酪氨酸残基上，抗原和抗体的结合部位就会有大量的酪胺荧光素沉积，使抗原位点处的荧光信号增强。

酪胺荧光素底物-抗原酪氨酸共价稳定结合，故TSA信号不会受微波影响，可用热修复法清除第一轮与抗原非共价结合的抗体复合物，并能在抗体去除后保留与抗原相关的荧光信号。然后，再用第二种一抗进行第二轮孵育，同时更换另一种酪胺荧光素底物，多次循环反复，不同的酪胺荧光素进行标记就可实现多重免疫组化染色。

TSA原理示意图

实验方法：

实验前准备：

1、PBS缓冲液、枸橼酸钠抗原修复液（或其他修复液）及3% H₂O₂溶液；

2、用于IHC-P的多个靶标一抗；

3、mIHC试剂盒（多聚HRP二抗、TSA荧光素、TSA增强剂）

操作步骤：

石蜡切片脱蜡至水→抗原热修复→阻断内源性过氧化物酶→血清封闭→

第一个一抗孵育→对应HRP二抗孵育→添加TSA染色工作液1→微波加热处理→

第二个一抗孵育→对应HRP二抗孵育→添加TSA染色工作液2→微波加热处理→

第三个一抗孵育→对应HRP二抗孵育→添加TSA染色工作液3→微波加热处理→

……

以此循环N次→细胞核复染DAPI→封片及检测

多重免疫组化原理示意图

TSA技术优势：

1. 提高信号放大倍数，显著扩增抗原相关荧光信号；

2. 可检测低蛋白丰度的靶标，提高实验体系灵敏度；

3. 可微波去除一抗/二抗及非特异性染色；

4. 降低一抗使用量，节约一抗成本；

5. 针对每张组织切片可收集到更多的数据，实现一张切片多达6种靶标的共表达；

6. 适合任何经IHC-P验证的抗体，同一样本中的靶标都可以选用高特异性的正能生物病理级抗体；

7. 可在同一样本中使用同一种属来源的多种一抗进行多标记识别，例如都选用兔单克隆抗体，避免了交叉干扰，同时解决了一抗二抗种属匹配限制问题。

产品信息：

我司开发的多重免疫组化试剂盒，具体TSA荧光染料参考如下：TSA-480，TSA-520，TSA-570，TSA-620，TSA-670，TSA-690，TSA-780。

试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用，可以实现双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大满足了淋巴细胞检测、肿瘤微环境等各领域实验需求。

• 产品货号：18002

• 产品名称：Goat Anti-Mouse/Rabbit Multiplex IHC Detection Kit (Double)

• 产品规格：50T/100T

• 结果展示：Immunohistochemistry analysis of paraffin-embedded chimera mouse carcinoma using F4/80 (Green) and CD206 (Red) antibodies.