未出现阳性信号是抗体相关实验的常见问题，常出现的有WB实验曝光后膜上一片空白等现象，需要根据具体的情况进行分析：
一、确认检测靶点在样本中的表达情况
一般来说，常见的蛋白可以在基因注释查询网站——BioGPS中进行查询。但应注意，该网站罗列的是基因对应编码蛋白在转录水平上的表达量。该表达量会与实际翻译产生的蛋白水平会有出入，仅能作为参考。低表达量的蛋白，在能检测到的情况下，可以提高抗体的稀释浓度来改善。
分泌型蛋白在细胞的正常表达中，会分泌到细胞外，胞内残留的蛋白含量比较少，这种时候，建议用含有蛋白的阳性样本（比如组织）作为对照进行比对，判断是蛋白含量低还是抗体特异性的问题。
磷酸化蛋白，以及一部分蛋白，需要进行药物的刺激，才能在样本中高表达，这种情况下，一般客户可能没有阳性样本，需要客户提供参考文献作为说明，我们根据参考文献中的具体报道，进行问题的判明。有时候，客户会忽视文献中样本的处理步骤，导致反馈的产生。
二、样本制备的问题
虽然很多时候，冻融过的样本可以进行重复，但是仍然有蛋白（例如小分子蛋白，分泌型蛋白等），在冻融之后会大量降解，使得先前可以做出来的结果，无法重复，这种时候，我们一般会建议客户进行新鲜样本 的制备和检测。
在裂解细胞或者组织时，选择合适的裂解液也十分重要，常见的RIPA裂解液适用广泛，但是对于膜蛋白或者核蛋白，我们建议用专门提取此类蛋白的protocol进行样本制备，以达到目的蛋白的大量收集。
三、实验操作不当
小分子蛋白极易降解，且吸附能力。转膜时应使用0.2μm的PVDF膜，并将甲醇浓度维持在20%，增强小分子蛋白在膜上的结合能力。转膜条件可设定为80v/1h，即使用较低的电压和适当的转膜时间。
对于分子量约10kd左右的某些分泌型蛋白，这类蛋白在电泳时极易弥散，导致抗体无法检测，出现没有信号的情况，小分子蛋白的实验操作可以进行优化，条件如下：
1. 配置SDS-PAGE胶时，加大浓缩胶的比例，使得浓缩胶：分离胶约为4：6，甚至可以5：5，这样可以让小分子蛋白在浓缩胶中充分的浓缩，在后续的分离胶实验中，减少弥散程度。
2. 电泳时，以80v电压进行压缩，时间约为40min，电泳至两种胶的界面。然后，将电压调整到100v，在12%-15%的分离胶中进行电泳，跑到分离胶一半的位置，一般10kd的marker能够分开就可以了，目的是避免长时间的电泳使得小分子蛋白弥散。（这种时候可能内参就不好检测了，但是为了检测出小分子蛋白，还是跑另一块胶检测内参吧）
3. 在转膜的时候，不要在转膜液中加入SDS，防止小分子蛋白与PVDF膜无法结合，可以将甲醇的浓度提升至30%，增强小分子蛋白与膜的结合。
4. 对于10kd左右的蛋白，转膜条件80v，30min就可以将蛋白转印，最多不超过60min，只要marker成功转移到膜上，相应的分子量就转移过去了。
大分子蛋白在电泳时，使用6%-8%的分离胶，200kd以上建议6%进行分离，转膜时胶比较软，轻拿轻放。同时，需要降低甲醇的浓度，10%即可，为了防止蛋白在凝胶中形成沉淀，可以在转膜时加入终浓度0.1%的SDS，条件为80v，根据蛋白的大小，3h-5h，甚至更久的转膜时间都是可取的，对于200kd以上的蛋白，建议20v，在4℃转膜O/N，可以得到比较好的效果。
封闭时，过长的封闭时间可能造成过度封闭使靶点结合抗体效率降低，洗膜也不宜过度，防止洗脱结合的蛋白。
大包装抗体，或者长期储存的抗体，由于静置时间过久，甘油可能分层，浮在表面。在稀释抗体时，可能会造成吸不到抗体的情况，每次使用建议瞬时离心，将甘油离心到管底，吸取上层保存液使用，避免这种情况的发生。